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文章解析：应用空间单细胞测序技术鉴别乳腺癌肿瘤的多克隆侵袭性

来源：时间：2018-04-12 08:55:28

摘要：Anna K Casasen 于January 11, 2018在Cell发表的文章《应用空间单细胞测序技术鉴别乳腺癌肿瘤的多克隆侵袭性》《Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic...

Anna K. Casasen 于January 11, 2018在Cell发表的文章
《应用空间单细胞测序技术鉴别乳腺癌肿瘤的多克隆侵袭性》

《Multiclonal Invasion in Breast Tumors Identified by Topographic Single Cell Sequencing》

图片摘要：

亮点：
l 研发了一项空间分辨单细胞基因组测序的方法
l 在导管原位癌-浸润性导管癌中，基因组演化先于肿瘤的侵袭行为
l 肿瘤侵袭源于多克隆的协同迁移至癌旁组织

应用空间单细胞测序技术鉴别乳腺癌肿瘤的多克隆侵袭性
摘要
导管原位癌（DCIS）是一类极少发展为浸润性导管癌（IDC）的早期乳腺癌。由于肿瘤内异质性以及导管内肿瘤细胞数量极少，肿瘤侵袭过程中的基因组演化往往难以描述。为了克服这些困难，作者开发了一项空间单细胞测序（TSCS）技术来测算单个肿瘤细胞的基因组拷贝数同时可以保留组织切片中单个肿瘤细胞的空间环境。作者利用TSCS技术对来自10例同期同时有DCIS和IDC的患者的1293个细胞进行了包括外显子测序在内的检测。作者得到的数据显示原位和浸润性肿瘤之间存在直接的基因组联系，并且进一步研究发现大多数突变和拷贝数变异在发生侵袭之前便在导管内发生了。通过这些结果得到了一种多克隆侵袭模型，一个或多个克隆会脱离导管并转移到附近的组织中，形成浸润性导管癌。
前言
导管原位癌（DCIS）是最为常见的一种早期乳腺癌，常常通过常规的乳腺钼靶检查便能发现。只有很少比例（10%-30%）的DCIS会进展为浸润性导管癌（IDC），而这也给决定何种患者进行怎样的治疗带来了很大的挑战。目前大组织分析技术水平面临着很多挑战，如乳腺癌肿瘤内存在大量的肿瘤异质性，导管内肿瘤细胞稀少，DCIS肿瘤间质细胞数量庞大，这导致了DCIS发生侵袭的基因组变化和演变过程至今仍不清楚。
目前有许多不同类型的侵袭演化模型。在独立的谱系模型中，乳腺组织中不同的起始细胞以各自的谱系进行平行演化，期间不共享任何基因组变异，从而导致了不同的乳腺癌亚型（DCIC和IDC）。这种模型获得了一项针对性研究的支持，该研究指出原位癌区和侵袭性区域的分子标记存在差异。相反，进化瓶颈模型认为导管内原位细胞和癌旁组织侵袭性细胞的基因组谱系存在直接联系。这种模型假设多克隆积累于导管内，之后单个克隆逸出基底膜并扩增形成侵袭性肿瘤组织。有研究报道了导管区和侵袭区存在一致性突变，并发现了侵袭过程中侵袭特异突变和拷贝数变异（CNAs），这些结果支持了瓶颈模型。然而，精确的克隆谱系在分析过DCIS大组织样本的研究中仍难以辨别。
单细胞DNA测序法是一种强有力的工具，这表现在分析肿瘤内异质性、描述间质细胞类型及发现稀有亚群等方面。该类方法可以从单个-时间-点样本中重建异质性肿瘤的演化谱系。然而，这种方法存在一个很大的掣肘，即大多数孤立细胞分离方法需要准备细胞悬液，这需要用到荧光活化细胞分选法（FACS）、显微操作、微滴、微孔等技术。这些技术不可避免的会丢失所有空间信息，而这对于像DCIS这样的需要组织病理学鉴别原位还是浸润性的早期乳腺癌又是十分关键的。
为了处理这一局限，作者开发了空间单细胞测序（TSCS）技术，将激光弹射和单细胞DNA测序结合起来，以测量单个肿瘤细胞基因组拷贝数，同时保留其在组织切片中的空间信息。作者假设侵袭性细胞与导管内单（或多个）孤立细胞共享直接的基因组谱系。为了研究这个问题，作者采用了TSCS和深外显子测序，来追踪10个同期DCIS-IDC高级别冰冻肿瘤标本的侵袭过程中的克隆演化。作者所获得的结果支持了原位和浸润性肿瘤细胞存在直接基因组谱系的观点并进一步证实在产生浸润性之前，大多数突变和CNAs都在导管中进化出来。这些数据提示多克隆从导管内逃逸并协同迁移至临近组织从而形成侵袭性肿瘤。

图1. DCIS组织中TSCS
（A）10倍镜下对同期H&E染色的DCIS组织进行全组织扫描。
（B）在激光弹射之前和之后63倍镜下紫外激光切割出单个细胞。
（C）激光弹射将单个细胞转至收集管。
（D）将单个细胞通过自动化机械存储储存至具有96孔歧管的含裂解缓冲液的8孔带管中，然后利用DOP-PCR进行全基因组扩增（WGA）。
（E）在Illumina平台上建立带条码的单个细胞库用于多路复用库和全基因组测序。
（F）加工出单个细胞和其X、Y坐标空间的明场图像。
（G）绘制组织切片中的空间坐标和基因组信息，显示正常细胞、原位肿瘤细胞和侵袭性肿瘤细胞的基因组拷贝数框架。
结果
空间分辨的单细胞DNA测序
为了从冰冻组织切片中分离单个肿瘤细胞同时保留其空间位置和原位癌形态，作者开发TSCS。这种方法结合了激光捕捉显微切割（LCM），激光弹射，全基因组扩增（WGA）和单细胞DNA测序（图1和STAR方法）等技术。首先，冰冻组织切片经低温切片机切割再进行H&E染色以通过组织病理学方法鉴别原位癌和侵袭性癌区域。通过全组织成像建立一个整体肿瘤组织图像以在激光捕捉之前兼备导管（原位）和侵袭区域。LCM通过1微米激光（图1B）将单个细胞切割出来然后利用高通量机械平台（图1D和STAR方法）进行激光弹射将细胞转移至收集管中（图1C）。激光弹射是一种利用紫外线能量转移细胞的免触控技术，因而与需要物理接触组织的标准LCM系统相比能减少细菌和临近细胞污染。作者优化了紫外激光参数以将紫外激光对乳腺组织DNA的损伤最小化，并将组织切片厚度精确至14微米以减少在冰冻切片机切割组织切片切到细胞核的可能性（STAR方法）。
细胞分离至裂解缓冲液中，利用遵循单个核测序（NGS）协议的简并寡核苷酸引物聚合酶链反应（DOP-PCR）进行全基因组扩增（WGA）（图1D）。准备好条形码库，将48-96单个细胞聚集起来进行多路复用下一代基因测序（NGS）（图1E）。完成NGS后，数据通过细胞条码库解编并加工以计算基因组拷贝数（精度220kb）（STAR方法）。基于这些优化参数，TSCS生成了可复制的高精度单细胞拷贝框架（图S1）。每个细胞的空间坐标也被提取出来并转化为多截面可用的形式（图1F和STAR方法）。单个细胞基因组信息绘制入坐标中以描述组织切片中不同克隆基因型的空间组成（图1G）。
同期的DCIS-IDC病例队列
作者选取了一个独特的含有10例DCIS-IDC患者冰冻切片的队列，所有切片均经组织病理学检测鉴别出了同期同一组织切片中原位和浸润肿瘤细胞（表S1和STAR方法）。同期的样本相比纯DCIS样本和复发IDC样本具有很多优点，后两者收集年限往往差距较大。纵向样本则会受干预治疗和空间采样差异影响，这些因素会导致出现与侵袭无关的额外突变。前期研究突出了利用同期DCIS-IDC样本研究乳腺癌侵袭的作用，因其可做到空间与时间匹配。作者的病例队列包括6例三阴性（ER-,PR-,HER2-）和4例雌激素受体（ER）阳性乳腺癌患者（表S1）。其中除P3、P4外的多数患者的肿瘤等级均较高。更重要的是，冰冻肿瘤样本是在治疗干预前收集的。为了对全基因组拷贝数进行定量，每例患者平均有129个单个细胞进行了测序。同时，采用LCM来分离数千原位和浸润区域的肿瘤细胞。每个区域（原位、侵袭、正常对照）都准备了外显子库并进行了高覆盖度的测序（mean=162.8X，SEM=18.9）以发现体细胞点突变（表S2）。对照正常乳腺癌组织同时进行高覆盖度测序（mean=144.1X，SEM=20.3）以鉴别和过滤生殖系突变。
患者8的肿瘤侵袭过程的拷贝数演化
作者在P8样本中通过TSCS测量组织切片中4个不同肿瘤区域（R1-R4）的85个原位细胞和150个侵袭细胞来研究侵袭过程中拷贝数的演化（图2）。进行；了SNS，并以220kb精度计算全基因组拷贝数（STAR方法）。作者进行了一维收集，从而发现了1个主要的二倍体细胞群（标记为N）和3个克隆非整倍体肿瘤亚群（标记为A,B,C）（图2A）。在每个亚群（A,B,C）中拷贝数高度相关（A=0.64，B=0.71,C=0.80 Pearson相关），这表明克隆扩增是稳定的。作者计算了这三个亚群的一致性并对三者进行了比较，同时鉴别出了除大量的亚群特有CNAs外的位于染色体2p（ALK），8q（MYC），14q（FOXA1）和21q（RUNX1）的共享扩增。克隆A在染色体4p（RHOH），9p（CDKN2A），Xq（COL4A5）存在局部缺失，而在17p（MAP2K3,NF1,BCAS3），12p（ALG10B,ERBB3），Xq（AR）存在局部扩增。克隆B在3p（FHIT），13（RB1），8p（DBC2）存在缺失而在2q（GALNT13），11p（WT1），Xp（PDK3）存在扩增。而克隆C共享了克隆B的大量CNA事件，包括7p（EGFR）上的扩增。
为了描绘侵袭过程的克隆演化，作者利用TimeScape（图2B和STAR方法）推测基因组系及绘制数据。这项分析鉴别出了一个进化于导管内的共同祖先，其
包括ALLK,MYC,FOXA2,RUNX1这些最终分歧形成克隆A和C的基因的扩增。克隆B是克隆C的共同祖先，但是在额外的RB1,FHIT,DBC2分歧进化出现了扩增。这些数据提示所有的3个克隆亚型在导管中从一共同祖先进化而来，这一过程先于侵袭过程，并最终协同迁移至周围组织中。侵袭过程中获得的这些数据没有发现新的CNAs，然而，作者发现侵袭区域的克隆A比例降低（40%到5%）了。
为了弄清楚克隆基因型和它们空间位置之间的关系，作者对不同的亚群（1组正常细胞和3组肿瘤细胞亚群）进行了多维度测量（MDS）。每个亚群包括了原位和侵袭性的分离的肿瘤细胞，原位和侵袭区域之间没有克隆基因型特异性关联（图2C）。MDS显示C和B亚群在高维空间是毗邻的，而A亚群则距离最远。
这4个组织切片区（R1-R4）的克隆基因型添加上了它们的坐标以描绘其空间位置，这样所有3种肿瘤克隆均在导管区和浸润区有了定位，没有一个区域只有一种基因型（图2D）。然而，克隆A更局限于导管区（R3），而克隆B和克隆C更多的出现在浸润性。与空间分布一致，作者发现克隆B和克隆C均存在EGFR扩增，而该扩增先前证实与细胞迁移相关。此外，克隆C存在额外的FHIT缺失，这一缺失先前证实可抑制上皮间质转移（EMT）过程和细胞迁移。

图2. P8的单细胞拷贝数框架
（A）单细胞拷贝数框架的集合热力图，开头字母表示获取单个细胞的主要亚群和组织区域（原位和浸润）。下面的面板表示主要克隆亚群的一致性框架，上方的注释是已知肿瘤基因的共有CNAs，下方的注释是相异的CNAs。
（B）通过TimeSpace标绘主要肿瘤亚群的克隆谱系，推测为共有祖先的标为灰色，并标记了克隆频率。
（C）原位和浸润区的单细胞拷贝数目框架的MDS标记
（D）4个不同肿瘤区域的组织切片空间图，单细胞标记为原位和浸润。肿瘤细胞以其克隆基因型或双倍体基因组进行颜色标记，导管则通过不同的颜色进行注释。
患者4（P4）的肿瘤侵袭过程的拷贝数演化
作者在P4样本中通过TSCS测量组织切片中2个不同肿瘤区域（R1和R2）的46个原位细胞和58个侵袭细胞来研究侵袭过程中拷贝数的演化（图3）。对单细胞拷贝数进行了分层集合，鉴别出了一个双倍体细胞亚群（N）和两组非整倍体肿瘤亚群（A和B）（图3A，upper panel）。每个亚群中单细胞拷贝数框架表现出了高度的相关性（A=0.89，B=0.60，Pearson相关系数），这表示克隆扩增是稳定的。一致性拷贝数框架发现两种克隆共享染色体1p基因扩增（MDM4，ABL2），另外还有许多亚群特异性CNAs（图3A， lower panels）。在克隆A中，作者鉴别出了许多局部扩增，包括染色体3q（EVI1），4p（CPEB2），11q（CASP12），13q（PCDH17）和染色体12q（CDK2，MDM2）扩增。相比之下，克隆B则有很多大半合子染色体缺失，包括3p（SETD2，FHIT），4（FGFR3，NEK1），5q（PIK3R1，APC），14q（AKT1），15q（NTRK3），16q（CDH1），17p（TP53，MAP2K4），18（SMAD4）和22（NF2）。
以主要亚群推测出的克隆谱系鉴别出了一个存在能导致导管内形成两组肿瘤亚群的染色体1q扩增的共同祖系：一组有许多肿瘤基因局部扩增，包括MDM2和CDK2（克隆A）；另一组有许多大半合子缺失，包括CDH1，TP53，FHIT，SDMAD4（克隆B）（图3C）。这些数据提示基因组拷贝数目演化发生于导管中并产生了两种主要肿瘤亚群。在侵袭过程中，克隆B的比例由16%增至67%，而克隆A在浸润组织中的比例则由84%降至33%。
MDS鉴别出了3种不同的细胞族群，分别为正常细胞（N）、克隆A肿瘤细胞、克隆B肿瘤细胞。MDS标记发现每个克隆基因型均包含原位和浸润肿瘤细胞，每个组织区域没有特意的基因型（图3B）。作者进一步描绘了两个组织区域（R1，R2）的克隆基因型的空间坐标，进而发现两种肿瘤克隆均定位于导管和浸润区（图3D）。该图也说明在区域1中大多数的正常双倍体细胞定位于浸润区，从而反映出从这些区域的中立细胞中通过组织病理学方法鉴别出间质细胞是很困难的。更深一步讲，这些数据表明克隆A在R2中高度定位于4个导管中（d1-d4），而克隆B则与浸润区相关性更大。与浸润空间定位一致，作者发现克隆B存在与细胞迁移相关的一些肿瘤基因的缺失，包括AKT1，APC，FGFR3，CDH1，SMAD4。

图3. P4的单细胞拷贝数框架
（A）单细胞拷贝数框架的集合热力图，开头字母表示获取单个细胞的主要亚群和组织区域（原位和浸润）。下面板表示主要克隆亚群的一致性框架，上方的注释是已知肿瘤基因的共有CNAs，下方的注释是相异的CNAs。
（B）通过TimeSpace标绘主要肿瘤亚群的克隆谱系，推测为共有祖先的标为灰色，并标记了克隆频率。
（C）原位和浸润区的单细胞拷贝数目框架的MDS标记
（D）4个不同肿瘤区域的组织切片空间图，单细胞标记为原位和浸润。肿瘤细胞以其克隆基因型或双倍体基因组进行颜色标记，导管则通过不同的颜色进行注释。
病例队列中肿瘤浸润过程拷贝数演化
TSCS检测了另8例同期DCIS-IDC患者来研究侵袭过程中的拷贝数演化。所有病例进行全组织扫描和组织切片HE染色已鉴别原位和浸润区进一步进行细胞分离。总计10例病人的425个原位和503个浸润细胞以及365个双倍体间质细胞进行了测序。对获得的数据进行分析并描绘克隆细胞亚组成和浸润过程的拷贝数演化（图4）。单细胞CNA框架簇发现大多数患者有1-5组主要肿瘤亚群，这些亚群均定位于原位和浸润区域（图4A）。
4例肿瘤（P2，P3，P7，P9）为单克隆型，而6例肿瘤（P1，P4，P5，P6，P8，P10）为多克隆型，在原位和浸润区中包含了很多亚克隆型（图2,3，S2，S3，S4，S5）。作者计算了单细胞CNA框架的Shannon多样性指数后发现在大多数患者中肿瘤浸润过程克隆多样性并没有很大的变化（图4B，STAR方法）。这些数据指出与基因组多样性数量与原位和浸润区发现的肿瘤亚群相关，并且与一种族群瓶颈一致，即因特异克隆基因型选择而导致克隆多样性减少。对10例DCIS患者的MDS分析在每例病例中鉴别出了1-6主要簇群，包括正常细胞（N）和1-5在高维空间常见的主要肿瘤亚群（A-E）（图4C）。另外，MDS标记发现在每组基因组群众，肿瘤细胞均定位于原位和浸润区。
从6例多克隆DCIS病例中推测出克隆谱系并通过TimeSpace进行标绘（图4D，S2，S3，S4，S5）。这些数据显示在所有病例中的细胞克隆亚群共享一个包含共有主体CNAs的进化起源，由此提示肿瘤可能是从导管中的单细胞进化而来的。这些数据与先前的一个独立谱系模型相异，该模型中不同的起始细胞分别进化为原位和浸润亚群。作者在每例患者中发现在导管和浸润区存在相同的克隆亚群。然而，作者也观察到了一些患者中克隆亚群比例的变化（P4,P6，P8），这提示一些基因型可能更具侵袭性。举个例子，在P4中，侵袭过程中克隆B比例从16%增至67%，而P6中，侵袭过程克隆C比例由19%增至49%。这些数据说明从肿瘤基因组是由导管内单细胞进化而来的，并演化为一种或多种克隆亚群，进而迁移到临近组织形成浸润性肿瘤组织。
克隆基因型和空间位置标绘
作者构建了tanlegrams来弄清楚克隆基因型分布和它们在多克隆肿瘤中的空间构成。计算单细胞拷贝数框架的基因遗传距离树并以最小重叠关系绘制空间树（X和Y轴）。在P4中，克隆A（81.5%）主要分布于导管内，只有数个细胞位于浸润区（n=7），而克隆B在浸润区比例则要高很多。在P5中，这两个主要克隆（A,B）出现在了所有的三个导管和浸润区中；但克隆B更多的局限于d2和d3区。在P6中，作者发现了5个克隆亚群，其中A,B,C更多的存在于浸润区，而D,E则主要标绘在了导管区（d1，d2，d5）。在P8，作者检测出了3中克隆亚群，其中B,C分别标绘于10个中的8个导管中，而克隆A主要定位在两个导管中（d1，d2）。在其他病例中（P10，P1）作者发现这些克隆平均分布在原位和浸润区域中。这些数据提示尽管所有的克隆均在原位和浸润区出现，但特异性亚克隆更多的局限在导管中，而其他的与浸润区的关系更大，这暗示它们可能存在相比更具侵袭性或迁移性的表型。

图6. 原位区和浸润区的外显子突变
原位区和浸润区激光捕捉显微切割后的外显子测序
（A）10例DCIS-IDC患者原位区和浸润区的外显子突变比例柱状图
（B）每例患者原位区和浸润区的非同义突变肿瘤图谱。突变的出现和缺失基于扩增子深度测序校验数据结果进行更新。已知的乳腺癌基因加粗标记，而深度扩增子测序校验的突变则为斜体标记。插图显示的是LCM分离出的原位和浸润区域明场图像。
（C）原位特异突变扩增子靶向深度测序
（D）侵袭特异突变扩增子靶向深度测序
侵袭过程的突变演化
作者通过LCM对原位和浸润区的成千的细胞进行显微切割并进行深外显子测序（mean=162.8X，SEM=18.9；图6）以研究侵袭过程的突变演化。为了从体细胞突变中鉴别出生殖系突变，作者将配对的正常乳腺组织（mean=144.1X，SEM=20.3）也同时进行了测序。通过作者获得的数据，作者检测了点突变，从而发现外显子突变总数（mean=23，SEM=3.3）在原位区和浸润区是高度一致的（t检验，p=0.868）（图6A）。为了鉴别两者不一致的特异突变，作者利用非同义突变构建了肿瘤图谱（图6B）。包括如TP53，PIK3CA,NCOA2，ABL2，PDE4DIP,AHNAK,RUNNX1在内的已知乳腺癌基因突变的大多数的非同义突变（mean87.4%）在原位和浸润区是不一致的，这提示这些突变发生于导管中并先于侵袭过程。然而，4例病例（P3，P4，P7，P8）中有一部分为原位区特异的突变（n=12）或浸润区特异的突变（n=11），这些突变在这些病例中并不是反复发生的（表S3）。
不是在发生侵袭前就是在侵袭发生后浸润肿瘤增大过程中，侵袭特异突变可能已在导管内以较低的比例存在了（低于外显子敏感度）。另一种可能是它们来源于不同的空间区域；然而这在DCIS-IDC同时存在的组织中是不可能的，因为这些细胞是取自同一组织切片的瘤旁组织。为了确定侵袭特异性突变发生于导管内还是在侵袭发生后，作者进行了高度覆盖（mean=453,446X）的靶向深扩增子测序鉴别原位特异和侵袭特异突变。同时，作者队配对的正常乳腺组织进行了相同的测序以获得位点特异性背景误差率并用deepSNV鉴别重要的突变。
扩增子数据证实，通过高度覆盖可检测到很多原位特异突变以很低的比例存在于浸润区。相比之下，在该检测中发现绝大多数的侵袭特异突变（8/12）为浸润组织独有，如P3的DRD1、CRY1，P4的TECRL，P7的SCNA4、PCDHA5，以及P8的SORBS2、LAMTOR1和AKAP6（表S5）。这些突变不可能在侵袭过程中起作用，因为它们是在浸润癌扩大过程中肿瘤细胞逃逸出基底膜后获得的。然而，在P8中，作者发现了几个突变（NCOA2，MMP8，RNF182，LTBP2）在侵袭前即低比例存在而在侵袭过程中比例增长（表S4）。这些突变中的MMP8是一种在破坏细胞外基质起重要作用的基质金属肽酶，LTBP2则与TGF-β相关并调节细胞黏附。
作者通过绘制纯肿瘤标准化线条图进一步研究了是否一致突变比例发生了较大的变化。这项分析显示5例患者中这些突变的频率在侵袭过程仅发生了微小的改变，而另5例患者至少有一个突变发生了高于0.5的频率。通过这些数据，7个突变——包括P1的MEGF9（19%到100%），P3的NPY4R（48%到100%），P1的AHDC1（33%到100%）和P8的4个突变，被发现在侵袭过程中存在大于0.5的频率变化（表S4）。然而，除P8外，大多数患者（P1，P3，P5）只有一个一致基因在侵袭过程中发生了较大的频率变化。
作者使用PyClone2推断浸润过程的克隆动态，以及利用种系发生学（CITUP）推测肿瘤的克隆形成力，进而收集突变频率并在纯化和拷贝数标准化后评估克隆亚群（图7）。这项分析在每例患者中鉴别出了2-5个主要亚群，这要比从单细胞拷贝数框架中发现的要高。一些作者通过单细胞拷贝数框架（P2，P3，P7，P9）发现的单克隆肿瘤通过推测的突变集分出了2-5个亚群。这些数据提示在拷贝数演化后导管中还存在正在进行的突变演化，这导致了之后出现的在侵袭周围组织前发生的亚克隆多样性。尽管有的克隆频率在侵袭过程中发生了变化，经外显子突变评价绝大多数病人中亚群总数仍维持一致。
讨论
在这项研究中，作者开发了一种空间解析的单细胞DNA测序方法，并将其应用于研究10例早期乳腺癌患者肿瘤入侵期间的基因组进化。作者的研究报告了三个重要发现。首先，作者显示基因组进化发生在导管内，在肿瘤细胞突破基底膜之前。其次，作者的数据表明，导管中的所有亚克隆均来自单个启动细胞，许多共同的躯干突变和CNA可以证明这一点。第三，作者的数据显示，一个或多个克隆通过基底膜共同迁移到相邻组织中以建立侵袭性肿瘤块。作者称该模型为“多克隆入侵”以将其与前人提出的DCIS浸润的进化瓶颈或独立谱系模型区分开（图S6）。与作者的模型一致，在单个DCIS患者中使用流式分选和单细胞拷贝数分析的研究也报道了多个克隆穿过基底膜的证据。（Martelotto等，2017）
作者的模型与先前的研究形成了对比，该研究假设肿瘤入侵期间的基因组进化经由种群瓶颈发生（Hernandez等，2012; Heselmeyer-Haddad等，2012; Sakr等，2014）或通过独立细胞谱系发生（Foschini 等，2013）。在作者的数据中，作者显示所有10例患者的原位和侵袭性区域都存在相同的亚克隆，没有在侵袭期间获得额外的CNA事件，也没有侵袭性特异性突变。这些数据表明，入侵期间没有某个克隆被选择通过进化瓶颈。此外，作者的数据不支持独立谱系模型（Miron等，2010; Sontag和Axelrod，2005），因为作者在所有肿瘤细胞中鉴定到大量共同的躯干突变和CNA，表明场效应没有独立地形成原位和侵入区域的两个不同克隆。
作者发现的克隆亚群的总数与先前的浸润性导管癌的报道(Gao等, 2016; Navin 等, 2010; Shah 等, 2012; Yates等,2015）相似，并且与拷贝数演化的间断模型一致，即基因组不稳定性的短暂“爆发”引起多个克隆稳定扩增，进而导致肿瘤发生(Gao 等, 2016; Navin 等, 2011)。然而，以前的研究无法解决基因组不稳定性的间断爆发是发生在导管内，还是发生在侵袭性肿瘤肿块扩大期间的问题，作者的研究数据则强烈支持第一种假设。虽然间断拷贝数的演化机制仍然未知，但作者推测端粒危机（Chin 等,2004）是一种合理的模型。有趣的是，作者的数据还显示，大多数体细胞突变（包括TP53和PIK3CA中的驱动突变）在肿瘤进展的最早阶段在肿瘤发生侵袭之前在导管中获得。
多克隆共同迁移到肿瘤侵袭区域引发了有趣的问题，通过这表明发生入侵或者通过（1）基底膜的屏障作用完全崩溃和肿瘤克隆随机逃逸到相邻组织或（2）肿瘤多克隆之间的合作共同突破基底膜的屏障作用。后者可能通过肿瘤克隆之间的互惠作用或共生作用发生，其中单个前导克隆突破基底膜并产生后续的克隆逃脱的途径。了解这些克隆在肿瘤侵袭期间相互作用将需要使用体内系统进行进一步的功能研究。
这项研究有一些显著的局限性。首先，队列大小仅限于10例患者，因此作者不能排除一些早期乳腺癌患者可能会遵循替代进化模型的可能性，特别是在低度恶性肿瘤中。其次，作者在每位患者中分析了有限数量的细胞，这可能导致取样偏倚。为了研究这个问题，作者计算了后部饱和度曲线（Gao 等人，2016），这表明作者采集了足够的细胞来检测大多数患者的主要肿瘤亚群（图S7）。第三，作者的研究没有研究表观遗传修饰或基质细胞类型，后者也可能调节肿瘤细胞侵入周围组织的能力（Hu 等人，2008; Sharma 等人，2010）。这些代表了可以用单细胞RNA和表观基因组分析方法解决的重要未来方向
TSCS和其他空间解析的单细胞测序方法在开放早期癌症研究的新途径方面具有巨大的潜力。特别感兴趣的是在具有明确组织病理学的早期癌症如结肠直肠腺瘤，小叶原位癌（LCIS），前列腺上皮内瘤形成（PIN）和胰腺上皮内瘤形成（PanINs）中对肿瘤起始和侵袭的分析。在这些癌症中，空间分辨率可以提供肿瘤克隆背景，组织和迁移的新见解，因为它们逃离基底膜并侵入周围组织。这些研究将开始揭示为什么一些癌前病变在患者的一生中保持惰性，而有些则进展为侵袭性疾病并最终导致患者发病的神秘问题。

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