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ctDNA液体活检在乳腺癌精准医疗中的应用

来源：时间：2018-03-15 08:09:54

摘要：中国人民解放军总医院王建东教授液态活检是2015年度世界十大突破技术之一，对于疾病症状、预后的检测、肿瘤治疗效果的评估等都可以起到很大的作用。一、关于ctDNA 循环肿瘤DNA( circulating...

中国人民解放军总医院王建东教授

  液态活检是2015年度世界十大突破技术之一，对于疾病症状、预后的检测、肿瘤治疗效果的评估等都可以起到很大的作用。
一、关于ctDNA
    循环肿瘤DNA( circulating tumor DNA，ctDNA) 是肿瘤细胞在坏死、凋亡后释放的一种游离DNA( cell free DNA，cfDNA) ，由于其在血液中循环，所以对ctDNA 的检测可以及时反映肿瘤状态。ctDNA作为一种“液体活检”，其简便、快捷、微创以及在一定程度上克服肿瘤时间和空间的异质性等优势，越来越受到研究者的青睐。
ctDNA当前已广泛应用于以下领域：
①治疗前肿瘤分子分型，参与靶向治疗选择决策;
②在治疗过程中评估肿瘤动态和负荷变化，实时监测治疗的有效性;
③监测微小残留病灶和复发、预后评估、监测耐药的产生以及发现新的治疗靶点。
ctDNA发现及应用的主要历程如下：1948年，循环游离DNA（cfDNA）被发现并能够分离出来，1989年，发现循
环DNA来自癌症患者的肿瘤细胞，2005年，通过分析循环DNA检测突变的第一个临床研究完成，随后大量研究开展。不同的肿瘤中，大多数卵巢癌、肝癌以及胰腺、膀胱、结肠，胃、乳房、肝脏、食管、头部和颈部肿瘤，神经母细胞瘤、黑素瘤可检测到的ctDNA。相比之下，不到50%的肾母细胞瘤患者或发生转移的肾脏、前列腺或甲状腺癌症，以及不到10%的胶质瘤患者可检测到ctDNA。
循环游离DNA通常是以蛋白质复合体形式存在的DNA双链片段，大小为180～10000 bp，从小碎片到大片段差异较大，因此其在血液中的半衰期也不尽相同。范围从10 min至2 h不等。ctDNA 的含量与肿瘤负荷有关，不同病史的个体间差异也很大。随着肿瘤进展，血浆ctDNA的含量会增加，晚期肿瘤患者或肿瘤转移患者的ctDNA 含量比早期肿瘤患者高。ctDNA总水平和突变水平与肿瘤负荷呈正相关。
ctDNA临床应用前景有以下几点：癌症检测（筛查或早期诊断），分子谱或预后，检测疾病残留，监测疗效，监测克隆进化。定量分析（疾病分期、疗效监测、预后）。基因组分析，突变分析，治疗推荐，监测克隆进化等。
二、ctDNA的检测
理论上，所有检测基因组信息的手段都可以检测ctDNA，但是由于以sanger测序为代表的一代测序方法检测敏感性不高，长久以来一直限制着ctDNA检测的发展。随着二代测序技术的出现，使ctDNA的检测成为可能。ctDNA检测最好的方法是全基因组测序，其优点为广泛适用，缺点为所需费用较高。
三、ctDNA在乳腺癌中的应用
    关于乳腺癌ctDNA的研究，可以追溯到1977年，Leon等人发现乳腺癌患者的血液中游离DNA水平显著上升，通过放射免疫检测法他们检测到这些游离DNA范围在0~2 000 ng/mL间波动。
此后，大量乳腺癌的ctDNA临床应用的文献被报道，这些应用主要集中在ctDNA与肿瘤负荷监测、药物疗效预测、复发转移风险评估、早期诊断及预后分析等方面。
ctDNA在乳腺癌中的应用包括：肿瘤负荷监测、药物疗效预测、复发转移风险评估、早期诊断及预后分析等。
    1.肿瘤负荷监测：ctDNA是监测晚期BC肿瘤负荷敏感、特异的生物标志物。Dawson等动态监测了30例晚期乳腺癌患者的ctDNA、循环肿瘤细胞(circulating tumor cell，CTC)和CA15-3水平。结果显示：
①与CA15-3、CTC相比，在治疗期间患者特异性ctDNA水平变化具有更高的敏感性和特异性；
②ctDNA水平变化与疗效相关性最强，ctDNA水平的增高平均能早于临床影像检查5个月提示疾病进展。
研究提示了对于晚期乳腺癌患者，ctDNA是监测肿瘤负荷敏感、特异的生物标志物，其水平变化提示肿瘤负荷变化从而反映药物疗效。在临床疗效评价不确定如疾病稳定，或是病灶分离情况出现时，ctDNA检测可能更有优势。
研究发现，ctDNA敏感性优于CA15-3，纳入30例PIK3CA或TP53突变或结构变异的晚期BC，收集141例血液样本，结果显示：ctDNA敏感性达96%（26/27），优于CA15-3的78%（21/27）。ctDNA敏感性也优于CTC，ctDNA敏感性达97%（29/30），优于CTC的87%（26/30）。ctDNA水平变化与疗效相关性最强，且ctDNA水平的增高平均能早于临床影像检查5个月提示疾病进展。研究中53%（10/19）的疾病进展患者平均于临床影像检查5个月前检测出ctDNA升高，提示疾病进展。
    对于早期乳腺癌患者，ctDNA的检测同样能提示肿瘤的负荷。Tangvarasittichai等研究了ctDNA水平与乳腺癌临床分期间的关系，发现Ⅱ~Ⅳ期患者ctDNA浓度显著高于术后患者和健康对照组，并且肿块大小、TNM分期、远处转移与ctDNA浓度是显著相关的。
另外，一项研究入组了87例接受新辅助治疗的乳腺癌患者，分别在新辅助治疗前、治疗后和术后1年监测ctDNA的甲基化(met-ctDNA)。结果显示，新辅助疗后的met-ctDNA与残留肿瘤负荷显著相关(P=0.008)。
新辅助治疗前、治疗后和术后1年监测ctDNA甲基化研究结果显示：：Met-ctDNA在监测NAC治疗效果方面，比CEA和CA15-3更为敏感；并且在监测预测肿瘤复发方面具有潜在作用。
2.药物疗效预测：Stoetzer等发现，新辅助化疗不敏感组患者治疗前cfDNA显著高于治疗获益的患者。提示治疗前cfDNA水平可能预测新辅助化疗获益程度。对Ⅲ期NeoALTTO试验的HER2扩增病例进行ctDNA检测，结果显示伴随PIK3CA 或p53突变的HER2阳性乳腺癌，在抗HER2新辅助治疗前，ctDNA检出可能意味着更低的pCR率。纳入15例乳腺癌患者，连续采集血液样本测定ctDNA水平和突变情况。结果显示：2例患者接受第1个周期新辅助化疗（NAC）之后ctDNA突变拷贝数消失，并获得了病理完全缓解（pCR）；ctDNA突变拷贝数总量与残留肿瘤体积（MRI结果）相关。Guttery等检测48例激素受体阳性晚期乳腺癌患者cfDNA的ESR1突变情况，初步探索了利用cfDNA技术预测乳腺癌内分泌治疗耐药的可行性。Murtaza等利用全外显子测序技术检测ctDNA用于获得性耐药预测的可行性。结果发现6个与不同药物耐药相关的基因突变，该研究首次证明全外显子测序技术检测ctDNA提早预测治疗耐药发生的可行性。cfDNA检测技术评估部分患者HER-2基因扩增尚待进一步研究。
3.复发转移风险评估：目前认为，晚期乳腺癌是不可治愈的，原因可能与临床诊断滞后相关。因此寻找早期、特异的指标检测微小转移灶，预测复发转移风险对于治愈肿瘤十分重要；既能通过治疗提早干预临床转移灶的出现，又能避免部分术后治愈的患者接受过度的辅助治疗。Olsson等通过全基因组测序筛选出20例乳腺癌患者原发灶可信的特异肿瘤相关染色体重排，之后采用高度敏感的微滴数字PCR方法，连续监测这20
例辅助治疗阶段患者循环血与原发灶中相同的特异性DNA的重排情况，发现其预测复发转移敏感变为89%，且平均早于临床复发转移11个月。首次证明了ctDNA用于乳腺癌复发风险监测的可能性。
    4.早期诊断：早期诊断是降低乳腺癌死亡率的最重要方法之一。现行筛查手段主要依靠影像学方法，但影像学检查的分辨率有限，有时难以区分良恶性，并且难以实现群体间的筛查。cfDNA检测因取样方便、检测结果判读客观可能成为乳腺癌早诊筛查的有力工具。
Gong等分析了乳腺良、恶性疾病患者、健康者cfDNA浓度，ROC曲线分析结果提示cfDNA用于诊断3组人群的特异性均大于0.9，提示cfDNA浓度的检测能够用于早期诊断。
Xi Wu等对分析了乳腺癌和健康女性血浆cfDNA端粒重复序列水平的差异，提示乳腺癌患者cfDNA端粒重复序列减少。
一项关于ctDNA甲基化的研究纳入了749例早期乳腺癌、良性疾病和健康者，仅检测6个基因的甲基化情况诊断乳腺癌的特异性和敏感性分别达到78.1%和82.4%，提示血浆中的表观遗传学的生物标志物具有潜在诊断价值。
Uehiro对cfDNA表观遗传学进行检测，也证实了血浆中的表观遗传学的生物标志物对于乳腺癌早期识别具有诊断价值。
  另外，ctDNA端粒重复序列减少可提示早期乳腺癌。cfDNA的表观遗传学检测从健康女性中识别乳腺癌患者准确度高；可与乳房X射线一样，用于早期乳腺癌患者的识别。
    5.预后分析：Meta分析结果提示高水平的cfDNA和ctDNA与实体瘤患者的不良预后显著相关。除近期的meta分析结果外，Madhavan等通过定量PCR方法检测了晚期乳腺癌患者cfDNA完整性及水平，结果显示cfDNA完整性与水平都能预测晚期乳腺癌无进展生存期(progression-free survival，PFS)和OS。
Dawson等的结果提示乳腺癌患者ctDNA水平与预后密切相关，含量越高5年生存率越低。
但是，与上述研究结果不一致的是Madic等纳入40例三阴性乳腺癌患者，采用NGS平台检测26例肿瘤组织存在TP53体细胞突变，并且在21例匹配的血样样本中检测相同TP53突变即ctDNA，结果并未发现这21例患者ctDNA的水平与疾病进展时间(time to progression，TTP)和总生存期(overall survival，OS)的相关性。
目前关于ctDNA的预后价值尚存在争议，各实验室间的结论并不一致，原因可能是多方面的，包括样本处理、操作规范、DNA提取、检测技术、入组人群等差异。
    随着精准医疗概念的提出，乳腺癌诊疗将从个体化走向精准；以基因检测为代表的精准诊断模式，将会是未来乳腺癌精准诊疗的重要组成部分。ctDNA检测技术的发展正是迈向精准诊断重要的一步。但目前该领域研究仍处于起步阶段，ctDNA研究还处于科研阶段，其临床应用仍然任重道远。

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