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2017乳腺疾病泉城论坛讲课精选之 复旦大学 柳素玲教授

来源: 时间:2018-02-07 08:55:20

摘要:Notch3和IL-6抗体在乳腺肿瘤干细胞抑制方面的联合治疗复旦大学 柳素玲教授乳腺癌有过有关流行病学不再赘述。自从1994年实验室提出白血病干细胞以来,认为不管在液体肿瘤还是实体肿瘤,都有一小部...

Notch3和IL-6抗体在乳腺肿瘤干细胞抑制方面的联合治疗
复旦大学 柳素玲教授

乳腺癌有过有关流行病学不再赘述。
自从1994年实验室提出白血病干细胞以来,认为不管在液体肿瘤还是实体肿瘤,都有一小部分细胞具有肿瘤干细胞的特性。在当今的放化疗的治疗中,肿瘤干细胞是不能够被消灭掉的,一段时间后都会形成新的肿瘤,所以造成肿瘤的复发和转移。
在2003年首先发现乳腺癌肿瘤干细胞,我们现在的主要研究目的是找到肿瘤干细胞的潜在靶向药物结合放化疗来治愈乳腺肿瘤,使所有的肿瘤细胞都被消灭掉。在2003年,密歇根首次发现CD24-/CD44+肿瘤细胞具有强的致瘤能力。没有这种表型的细胞在免疫缺陷小鼠是无法形成肿瘤,而具有这种表型的临床亚体来源的肿瘤细胞大约两百个就能形成一个肿瘤。
刚刚加入密歇根的时候,建立肿瘤干细胞的模型。我们从临床拿到不管是正常的,还是异常的乳腺肿瘤,消化成干细胞之后,大概有千分之四的细胞形成微球体。微球体和普通的肿瘤细胞培养是不一样的,不贴壁培养,不加血清,但是加入一些生长因子。这些微球体形成的细胞可以无限制的传代下去,自我更新。同时我们将这些微球体形成的细胞在二维或者三维培养体系里面发现它们可以分化成其他细胞,包括上皮细胞、肌上皮细胞,形成乳腺的导管结构。这些微球体形成的细胞可以移植到免疫缺陷的小鼠,并形成乳腺导管结构。如果让小鼠进行怀孕,这些结构具有分泌乳汁的功能。
在临床上和beta医学院实验室,我们取化疗过程中不同化疗疗程的活检组织,消化成干细胞。进行干细胞的分析,发现随着化疗的推进干细胞的百分数在增加,存在富集的过程。我们证实这些干细胞不是因为增加了自我更新,而是因为消灭了一般的肿瘤细胞,使肿瘤干细胞有一个提升和富集。在放疗的情况下,肿瘤干细胞也是存在上升的过程,CD24-/CD44+细胞富集。
这部分肿瘤干细胞到底是受什么样的调控。
我们做了一系列基因芯片的分析,结果发现Notch表达。Notch是比较熟悉的存在,在发育生物学和一般正常干细胞报道是一个重要的调控通路。Notch分为胞外段、跨膜段、胞内段。Notch的激活,必须通过配体和受体结合。配体大概有五种,受体有四种。大部分研究都是集中在Notch1。刚才陈策实教授介绍Notch1的研究。Notch在肿瘤和肿瘤干细胞都有报道,认为是oncogene。有一篇肺癌的研究报道认为是tumor suppressor gene。国内一位教授发表一篇关于Notch抑制肿瘤的转移,与我们的发现是非常相似的。在干细胞中Notch1和Notch4起到正调控的作用。激活Notch1和Notch4使肿瘤干细胞的自我更新会得到很大的增强。Notch在肿瘤的血管生成中也起到非常重要的作用。所以,针对这些研究制药公司研究抑制Notch信号通路观察是否会对乳腺肿瘤治疗起到帮助。
有一个酶叫Gramma Secretase,相当于一把剪刀。当配体和受体结合后。酶将胞内段释放出来,使胞内段进入细胞核,引起一系列转录因子的激活,同时促进肿瘤细胞的增殖和转移。制药企业主要是合成针对这种酶的抑制剂或者是针对配体或抗体的生产。
结果在临床上应用发现pan-Notch抑制剂疗效非常差,毒副作用大。可能因为Notch在发育生物学中作用大,尤其是在胃肠系统正常的干细胞中起很重要的作用,所以抑制Notch通路起很大的副作用。我在密歇根做博后的时候,博后老板是乳腺肿瘤干细胞的发现者。他们专门成立一个公司专门研究靶向肿瘤干细胞药物抗体,合成Notch2和Notch3抗体。因为Notch1234非常相似很难生产专门针对某一个Notch起作用抗体。所以他们只能最好做到的就是同时拮抗Notch2和3。因为Notch2在肿瘤干细胞报道中是非常重要的。应用到一线治疗胰腺癌中,去年的时候临床治疗试验宣布失败。在胰腺癌治疗,对比用药和不用药的病人疗效没有差异。
对我们当时正在做的研究非常受打击,我们分析假设是否同时抑制Notch2和3是产生不好疗效的原因。因此我们打算在细胞水平分别抑制Notch2和3,首先用了pan-Notch抑制剂发现可以抑制所有的Notch,使NICD产生下降。但是肿瘤干细胞有一个极大的富集作用过程。从百分之几到百分之二十几,或者在lunimal乳腺癌肿瘤干细胞增加一倍,同时微球体的形成有一个大大增强。我们研究干细胞的一些标志物都是有上升的。这些检验的结果都证明了这个小分子抑制物施加之后,干细胞是富集和增强的效应。
如果改变细胞的生存环境,会引起细胞分泌一些蛋白,我们对膜蛋白和分泌蛋白非常感兴趣。我们发现当加入小分子抑制剂时,IL6在剩余肿瘤细胞中有很大的提升。我们加入小分子抑制剂的同时加入IL6抗体单抗药物,发现可以拮抗小分子抑制物富集的肿瘤干细胞,使肿瘤干细胞下降,同时微球体形成能力下降。
因为小分子抑制剂是对所有的Notch起作用的。那么到底是通过哪一个Notch引起IL6的分泌?所以我们单独敲击Notch1、2、3,发现只有敲击Notch3时,IL6上升,和Notch1、2没有关系。Notch4敲击很难做到,因为Notch4在所有的肿瘤中表达很低,唯独在肿瘤干细胞表达非常高。所以单独敲击Notch4很难看到水平变化,只能将干细胞和其他细胞分离,再去进行。
我们想研究Notch3在乳腺癌表达中是起一个什么作用,有没有跟乳腺癌的恶性程度相关性?结果发现在三阴性乳腺癌中Notch3是一个很低的表达,western看到同样效果。通过对临床病人组织进行染色,Notch3高表达病人存活率比较好。所以与Notch3作为oncogene理论是不一样的。我们在Notch3高表达低级别的乳腺癌中敲击,发现肿瘤的生长极致增加,并且肿瘤干细胞的比例大大提升。Notch3敲击效果很好,因此IL6大量分泌。我们在Notch3敲击的肿瘤中施加IL6抑制剂,肿瘤受到很大抑制。而没有IL6抑制剂的肿瘤生长非常快,达到了对照组水平。Notch3敲击激活了IL6的分泌同时激活下游STST3磷酸化,从而增加肿瘤干细胞自我更新。Notch下游通路非常复杂,我们对下游所有基因都做检测来明确是哪一个因子起作用。发现当Notch3敲击的时候,与其他Notch敲击不一样的变化是Hey2。在Notch3敲击的过程中,它是下降的。在Notch3敲击的细胞系中Hey2使IL6上升,证实了Notch3敲击和Hey2都会使IL6提升。
在Notch3敲击细胞系中过表达Hey2能不能逆转这个效应,来证明这个通路是特异性的。所以在Notch3敲击过表达Hey2发现IL 6的释放受到抑制,证实了Hey2介导Notch3引起IL6分泌的关键效应因子。
我们想到证实治疗效果,将小鼠注射Notch3表达细胞系,对照组和施加IL6抗体药物组肿瘤缩小非常小。但是,施加pan-Notch抑制剂和IL6抑制剂,肿瘤的抑制效果都很好。从临床上看对联合应用和单独应用小分子的对肿瘤大小效果是一样的。当看到肿瘤干细胞单独用Notch抑制剂时,干细胞的比例是上升,联合应用时比例是下降的。
我们做肿瘤干细胞的金标准是二次成瘤实验。将primary tumor药物处理后,剩下的肿瘤细胞分离出不同数量五百个或一千个植入到免疫缺陷小鼠中,可以看到经联合治疗的肿瘤二次成瘤能力非常低。有公式计算,联合治疗中三万个肿瘤细胞中有一个肿瘤干细胞。所以说联合治疗可以大大抑制肿瘤干细胞。
我们也做了一些低氧微环境影响。今天先不详细讲。不管是低氧还是乏氧的情况下,如果肿瘤Notch3表达,施加Notch3抑制剂可以通过Hey2上调IL 6,所以我们要联合IL 6的治疗来更好的治疗乳腺肿瘤,起到更好的疗效。
总结:大家会问为什么要用pan-Notch抑制剂,因为Notch1、2、4对肿瘤乳腺肿瘤干细胞起非常重要有正向的调控作用,抑制肿瘤干细胞更新。但是,在乳腺癌中有Notch3的表达,pan-Notch抑制剂同时抑制Notch3,造成IL 6上升。为了逆转这个负效应,我们应用IL 6拮抗剂联合pan-Notch抑制剂,才能更好治愈乳腺肿瘤。

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